24.09.2007 | Наука

Индустрия близнецов 1

Десять лет назад появилась на свет овечка Долли – это достаточный срок, чтобы спокойно разобраться в произошедшем

Чуть больше десяти лет тому назад, в феврале 1997 года из Шотландии поступило сообщение, вызвавшее бурю эмоций во всем мире. Группа сотрудников института Рослин во главе с доктором Иэном Уилмутом опубликовали в журнале Nature статью о том, что они вырастили до взрослого состояния овцу, представляющую собой клон – точную генетическую копию другой овцы. При этом исходным материалом послужила соматическая клетка взрослого животного.

Информационный шквал, поднятый появлением на свет овечки Долли, был так силен, что сейчас даже удивительно, что десятилетний юбилей этого события прошел почти незамеченным. Впрочем, десять лет – вполне достаточный срок, чтобы спокойно разобраться в произошедшем и подвести некоторые предварительные итоги.

Корни и клоны

Согласно социологическим опросам, значительная часть жителей развитых стран – в том числе и России – решительно не одобряет клонирование. Вероятно, многие из сторонников такой позиции сильно удивились бы, если бы им сказали, что они не только регулярно едят продукты, приготовленные из клонированных организмов, но и сами занимаются клонированием. Между тем это именно так:

усы клубники, саженцы сортовых яблонь и слив, разделенные корневища пиона или ревеня, отрезанный и укорененный кусочек листа каланхоэ или сенполии (узамбарской фиалки) – все это не что иное как клоны исходных растений.

Они образуются каждый раз, когда размножение не сопряжено с половым процессом, – ведь при этом дочернему организму достается точная копия материнского генома.

Такое размножение называется вегетативным. Многие растения практикуют его и без помощи человека, а для некоторых (например, всем известного ландыша) именно этот способ – основной, а размножение половым путем – редкая и нечаянная удача. Вегетативное размножение нередко встречается и у животных – в основном у просто устроенных, состоящих из немногих типов тканей. Для одних – губок, полипов, плоских червей планарий – это обычный способ размножения, чередующийся с половым. Другие – дождевые черви, морские звезды – по своей воле так не размножаются, но если их разрезать на куски, то каждый фрагмент может достроить себя до целого организма. Однако

чем сложнее и совершеннее животное, тем меньше шансов обнаружить у него вегетативное размножение. В частности, ни один вид позвоночных к нему не способен.

Однако даже самые сложные существа появляются на свет в виде единственной клетки и затем повторяют вкратце эволюционный путь своих предков. И то, что невозможно для взрослого организма, оказывается обычным делом для эмбриона. В 1892 году знаменитый немецкий эмбриолог Ганс Дриш взял оплодотворенную яйцеклетку морского ежа и после того, как она первый раз поделилась, разъединил получившиеся клетки. Из каждой половинки развилась нормальная личинка, а затем и здоровый еж. Спустя девять лет другой ученый, Ганс Шпеман проделал то же самое с яйцеклеткой позвоночного животного – лягушки. Несколько позже Шпеман извлек ядро одной из клеток 16-клеточного зародыша и пересадил его в яйцеклетку (собственное ядро которой было предварительно разрушено) – и из нее опять-таки развился нормальный организм. Шпеман надеялся, что этот опыт удастся повторить и с ядрами клеток взрослого животного, но лабораторная техника того времени была слишком груба для такой работы.

Подобные эксперименты широко развернулись только в 50-е – 60-е годы прошлого века. В 1952 году американцы Роберт Бригс и Томас Кинг пересадили в яйцеклетки ядра клеток зародыша на одной из ранних стадий развития – и вырастили здоровых лягушек. Дальше началось настоящее соревнование: нужно было взять «донорские» ядра из как можно более зрелых клеток и подвести получившийся зародыш как можно ближе ко взрослому состоянию.

Так к началу 70-х годов английским исследователям удалось получить взрослых лягушек из яйцеклеток, в которые были пересажены ядра клеток кишечника головастика. И наоборот: если донорское ядро бралось из ткани взрослой лягушки, зародыш удавалось дорастить только до стадии головастика.

Не осталась в стороне от этой гонки и наша страна – правда, начав с фальстарта. В конце 1940-х годов советский эмбриолог Георгий Лопашов первым разработал метод пересадки ядер в яйцеклетку лягушки. Статья была сдана в журнал в июне 1948 года, но света не увидела: грянула печально известная сессия ВАСХНИЛ, на много лет пресекшая все сколько-нибудь серьезные исследования в экспериментальной биологии. Бригсу и Кингу пришлось заново раскрывать секреты, уже раскрытые Лопашовым. Тем не менее и в последующие десятилетия наши ученые успешно участвовали в работах по клонированию. Так в 1987 году коллектив во главе с профессором Левоном Чайлахяном успешно клонировал лабораторную мышь. Правда, ядра были  взяты опять-таки из клеток зародыша очень ранних стадий развития.

Первоначально целью этих работ было выяснить, действительно ли в каждой клетке организма сохраняется вся генетическая информация, которая была в оплодотворенной яйцеклетке (зиготе). К 1970-м годам в этом уже никто не сомневался.

И тем не менее получить полноценный взрослый организм из ядра зрелой клетки взрослого животного никак не удавалось. Особенно трудно продвигались работы по клонированию млекопитающих.

Партитура для генов

Причины этих неудач отчасти выяснились, когда ученые узнали кое-что о том, как работают гены в развивающемся зародыше. Как известно, ген – это участок ДНК, в котором закодирована последовательность аминокислот в определенном белке. Специальные внутриклеточные структуры – рибосомы, считывая этот код, синтезируют соответствующий белок. Но считать его прямо с гена они не могут – ген пребывает в ядре, где никаких рибосом нет. Для синтеза белка с гена снимается «рабочая копия» – информационная (она же матричная) РНК. Она выходит из ядра в цитоплазму, где служит основой для синтеза некоторого числа белковых молекул, а затем уничтожается специальными ферментами-нуклеазами. Каждая клетка организма (за немногими исключениями вроде эритроцитов, лишенных ядра) хранит все доставшиеся ему гены, но матричные РНК снимаются лишь с немногих – тех, чьи белки нужны в данный момент. Остальные гены «молчат».

Так вот оказалось, что на самых ранних стадиях развития зародыша «молчат» все его гены. Они в это время заняты другим – спешно удваиваются, чтобы тут же, плотно упаковавшись в хромосомы, разойтись по делящимся клеткам и снова приступить к удвоению.

Между делениями клетки практически не растут, но какие-то белки в них все-таки синтезируются. Этот процесс обеспечивают матричные РНК, наработанные яйцеклеткой еще до оплодотворения.

Ученые до сих пор не знают, какой фактор в определенный момент включает синтез матричных РНК на генах зародыша и как он узнает, что момент настал. Но рано или поздно собственные гены зародыша прерывают молчание и направляют в цитоплазму свои РНК. У большинства животных это происходит на стадии гаструляции – когда шарообразный зародыш образует с одного бока вмятинку. У некоторых – несколько раньше. У млекопитающих включение собственных генов происходит особенно рано: так, например, у мышиного зародыша некоторые гены включаются уже после первого деления зиготы.

Обратите внимание: молчание прерывают именно некоторые, строго определенные гены. Потом к ним добавляются другие – столь же строго определенные, за ними – третьи – и т. д. Все это напоминает игру огромного оркестра, где каждый инструмент вступает строго в свой черед и ведет свою партию, сообразуясь с игрой остальных.

И как же в таком случае выглядит пересадка ядра зрелой клетки в зиготу? Представьте себе: вот-вот должна начаться увертюра, дирижер уже постукивает палочкой по пульту, скрипачи заносят смычки – и тут весь оркестр исчезает неведомо куда, а на его месте оказывается совсем другой, вовсю наигрывающий что-то из третьей части того же опуса. Дирижер (оставшийся от того, первого оркестра) отчаянно машет палочкой, музыканты растерянно смотрят то на него, то в ноты... Трудно представить, что такому оркестру удастся быстро и согласованно перейти к началу произведения и сыграть его затем целиком.

Вот и развитие клеток с пересаженными ядрами отличалось грубыми нарушениями и заканчивалось неизбежной гибелью зародыша. Для того, чтобы клонировать животных, нужно было научиться как-то согласовывать, синхронизировать состояния цитоплазмы зиготы и пересаженного ядра.

Эту задачу и сумела решить группа Иэна Уилмута, обеспечив себе тем самым мировую славу. Исходной точкой работы шотландских ученых стал установленный еще в 1980-е годы факт: если культуру взрослых клеток посадить на «голодный паек» – в среду, где концентрация всех питательных веществ впятеро меньше оптимальной, – клетки утрачивают признаки специализации, а их ядра становятся почти неактивными. Это очень похоже на состояние зиготы. Может быть, такое ядро сумеет синхронизироваться с ее цитоплазмой?

Для опытов были выбраны клетки молочной железы взрослой овцы породы Finn Dorset.  Выдержав их в бедной среде, ученые объединяли их с яйцеклетками овец другой породы – Scottish Blackface, из которых предварительно были удалены собственные ядра. «Голодные» клетки вымени и безъядерные яйцеклетки попарно присасывали к кончику микропипетки и, когда они соприкасались, пропускали через них электрический разряд. Мембраны клеток сливались, и образовавшаяся «зигота» начинала дробиться. Некоторое время «реконструированный» зародыш развивался в пробирке или в перевязанном яйцеводе «промежуточного реципиента» (еще одной овцы), а на определенной стадии его подсаживали в матку «окончательной» суррогатной матери.

Даже при таких ухищрениях выход «продукции» оказался ничтожным: использовав 277 яйцеклеток и создав 247 «реконструированных» зародышей, группа Уилмута сумела вырастить одно-единственное животное – Долли.

(Ранее, в 1993-95 годах рослинской команде удалось произвести на свет и дорастить до 8-9-месячного возраста двух клонированных ягнят, но источником ядер для них послужили клетки эмбрионов.) Специальные анализы подтвердили: Долли – точная генетическая копия овцы, от которой были взяты клетки молочной железы. Других генов – в том числе генов донора яйцеклетки и суррогатной матери – у нее нет. Принципиальная возможность клонирования взрослых млекопитающих была доказана.

Идентичные, но непохожие

Как и следовало ожидать, по пути, открытому Уилмутом и его сотрудниками, сразу же устремились многие. В том же 1997 году, когда шотландцы объявили о своем достижении, американские ученые получили двух клонированных макак-резусов. На следующий год команда эмбриологов Гавайского университета во главе с Рюзо Янагимачи поставила на поток клонирование мышей. Мыши – особенно неудобный объект для клонирования из-за малых размеров яйцеклетки и очень раннего включения собственных генов зародыша. Но группе Янагимачи удалось усовершенствовать метод Уилмута, создав микропипетку, с помощью которой можно было извлекать ядро из соматической клетки и внедрять его в лишенную ядра яйцеклетку. Затем последовало клонирование коров, свиней, кошек, собак... Далеко не каждая попытка оказывалась удачной, но список животных, которых удалось клонировать, уже довольно велик и продолжает расти. И вместе с ним растут знания о клонированных животных и о возможностях этого метода.

За эти годы эффективность клонирования удалось увеличить на порядок, но она по-прежнему остается до обидного низкой: в лучших лабораториях до рождения доживают всего около 3% клонированных эмбрионов.

Причины все те же: несогласованность зрелого ядра с цитоплазмой яйцеклетки (метод Уилмута лишь несколько сглаживает эту трудность, но не снимает ее полностью) плюс травматичность процедур удаления и пересадки ядер и других манипуляций с клетками. Сами животные, рожденные в результате клонирования, также более подвержены болезням и порокам развития, чем их обычные собратья. Например, Долли прожила меньше семи лет (около половины средней продолжительности жизни для ее породы), долго страдала артритом и была усыплена ветеринарами, когда у нее развилось заболевание легких. Однако эти нарушения не неизбежны: многие клоны живут вполне здоровыми. Потомство же клонов, рожденное естественным путем, оказывается не более хилым, чем обычные животные.

Генетическое сходство клонов с исходным организмом и друг с другом (если было получено несколько клонов одного животного) является абсолютным: различить их ткани не могут даже их собственные иммунные системы.

В то же время иногда копию можно отличить от оригинала даже на глаз. С этим столкнулись, например, Дуэйн Крамер и его коллеги – сотрудники Техасского сельскохозяйственно-политехнического университета, создавшие первую в мире клонированную кошку Сиси. Ее имя образовано от первых букв английских слов carbon copy, т. е. «экземпляр из-под копирки». Тем не менее на ее шкурке отсутствуют золотистые пятна, украшающие кошку Рейнбоу, с которой была скопирована Сиси. Дело в том, что у кошек рисунок шкуры (т. е. распределение пигмента на поверхности тела) не определяется однозначно генами, а складывается в ходе индивидуального развития – в значительной мере под влиянием случайных факторов. Кроме того, клон может отличаться от оригинала за счет так называемого «генетического импринтинга» – инактивации одного из двух имеющихся в каждой клетке экземпляров гена.

Каким образом клетка выбирает, какой именно ген инактивировать, пока неясно, но у клона и оригинала этот выбор может оказаться разным.

Подобные феномены стали одной из причин того, что калифорнийская компания Genetic Savings & Clone, созданная специально для клонирования домашних любимцев, осенью прошлого года объявила о прекращении своей деятельности. За три года своего существования компания сумела продать только двух клонированных котят, выручив по 50 тысяч долларов за каждого.

Кстати, по мнению многих нейробиологов, тонкая структура мозга и специализация нейронов тоже не жестко детерминированы генетически, а складываются в процессе индивидуального развития. Это означает, что характер и индивидуальные особенности поведения клона тоже могут отличаться от оригинала. И действительно, создатели Сиси утверждают, что она более любопытна и общительна, чем сдержанная Рейнбоу. Еще более резкие отличия отмечены в поведении клонированных поросят.

Продолжение тут

Источник: "Вокруг света", 2007, № 9,