08.04.2008 | Наука

Генетика отсутствия

Складывается впечатление, что в нашем организме вообще не бывает «единственных путей» и «единственных ключей»

К концу ХХ века генетика и ее дочь и наследница – молекулярная биология более-менее прояснили то, что происходит в живых организмах с наследственной информацией. Удалось выяснить, как она хранится, воспроизводится, передается, перетасовывается; как в ней исправляются ошибки, как с нее снимаются рабочие копии и как на их основе создается генный продукт – белок. И хотя открытия в этой области продолжаются,

имеющиеся знания уже подталкивали к попытке ответа на следующий вопрос: а как все это работает?

Как линейный и стабильный генетический текст воплощается в трехмерный, пластичный, развивающийся организм?

 

Вычитание гена

Что делает человек, когда ему надо разобраться в очень сложном техническом устройстве, к которому нет описания и не у кого спросить? Обычный путь – убирать по одному элементы (скажем, отключать проводки) и смотреть каждый раз, что будет. Именно этим путем и пошла наука, пытаясь проследить роль каждого гена.

Но убрать из организма индивидуальный ген несколько сложнее, чем отключить проводок. Физически ген представляет собой образование около 2 нм в диаметре и несколько сот или тысяч – в длину. Его невозможно увидеть даже в самый сильный микроскоп или подцепить даже самым тонким манипулятором. С другой стороны, даже небольшое животное, вроде мыши, состоит из невообразимого множества клеток (одних только В-лимфоцитов около 50 млн) – и в каждой из них есть ген, который нужно убрать, да еще в двух экземплярах.

Задача кажется безнадежной, но именно ее решение и принесло нобелевские лавры Мартину Эвансу, Марио Капеччи и Оливеру Смитису.

Сегодня, 20 лет спустя, все выглядит предельно просто. Известно, что гомологичные (т. е. одинаковые или очень сходные) участки ДНК могут вступать в контакт друг с другом и обмениваться участками. Все существа, у которых есть хоть какая-то форма полового процесса, используют это для перетасовывания генов перед тем, как передать их следующему поколению. А что, если сконструировать участок ДНК, в целом гомологичный интересующему нас гену, но с какой-нибудь подлостью внутри – скажем, со стоп-кодоном (сочетание букв-нуклеотидов, служащее командой немедленно прекратить синтез белка)? Если такой искусственный ген будет обмениваться участками с натуральным собратом, он с какой-то вероятностью передаст ему дефектный фрагмент – и тем самым выключит ген-мишень из работы.

Современные методы манипуляции с ДНК заслуживают отдельного разговора.

Здесь достаточно сказать, что они позволяют получить копию нужного гена и вставить в нее «сюрприз». Затем эта конструкция в свою очередь вставляется в вектор – молекулярный конверт для доставки ее внутрь чужой клетки. Обычно для этого используются природные переносчики генетической информации – плазмиды (небольшие кольцевые молекулы ДНК, существующие в бактериальных клетках отдельно от их основного генома) и вирусы – из которых предварительно вырезают все лишние собственные гены, оставляя только те, что обеспечивают доставку «груза» по назначению. Вектор нужно изготовить во множестве экземпляров, но тиражировать молекулу ДНК – не проблема. Обычно для облегчения проникновения вектора в клетку применяют электрический ток, повышающий проницаемость клеточной мембраны. Иногда вектор просто впрыскивают внутрь клетки микроинъектором.

О клетках, которые обрабатывают таким образом, надо сказать особо: это не что иное как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из зародышей животных (мышей) на ранних стадиях развития. Их ценность в том, что они могут развиться в любой тип клеток любой ткани организма. Клеток приходится обрабатывать много: несмотря на все ухищрения вероятность гомологичной рекомбинации (внедрения «сюрприза» в ген-мишень) даже при использовании самых эффективных конструкций не дотягивает до сотой доли процента . К тому же нужно еще как-то узнать те немногие клетки, в которых рекомбинация свершилась. Для этого в вектор наряду с основным содержанием вставляют еще и ген устойчивости к антибиотику. А обработанные им клетки высаживают на питательную среду с антибиотиком – выжить на ней могут только те, у кого есть ген устойчивости, т. е. успешно трансформированные. Остальные гибнут, но рекомбинантные ЭСК, размножаясь, быстро восполняют потери.

Культура ЭСК с выключенным геном-мишенью – это тоже интересно, но задача-то была выключить этот ген в целостном организме! Оказывается, и это возможно.

Мартин Эванс догадался вводить рекомбинантные ЭСК в мышиные эмбрионы – такие же, как те, из которых они были взяты – и подсаживать получившиеся химеры мышам-самкам. Эмбрион не умеет считать свои клетки, а иммунной системы в нем еще нет (когда она появится, она по умолчанию будет считать все имеющиеся в эмбрионе антигены «своими»). Рекомбинантные клетки, смешиваясь с собственными ЭСК эмбриона, входят в состав формирующихся тканей мышонка. Каких именно – дело случая, но если наделать много химерных мышат, среди них обязательно найдутся такие, у которых рекомбинантные ЭСК дадут начало половым клеткам. Скрещивая их между собой, можно получить животных, у которых ген-мишень будет выключен во всех клетках организма.

Из сказанного ясно, почему главным объектом «нокаутирования» стали именно мыши. Методика требует большого числа попыток и минимум двух поколений животных, поэтому объект должен быть плодовитым и с быстрой сменой поколений. С другой стороны, генетика мыши изучена более подробно, чем какого-либо другого млекопитающего; ее геном полностью расшифрован. При этом все основные биохимические системы мышиного организма мало отличаются от человеческих.

Врата великих возможностей

Технология, описанная выше, была разработана Капеччи и Смитисом (соединившими свое умение выключать ген в клетке с умением Эванса превращать клетки в живых мышей) во второй половине – конце 1980-х годов.

Но звездный час «генного нокаута» наступил еще через несколько лет, когда чтение нуклеотидных последовательностей (генетических текстов) превратилось из головокружительного достижения в стандартную лабораторную методику.

Логика была понятна: теперь мы можем прочесть любой ген, прочтя, сделать его копию, с ее помощью выключить его – и узнать таким образом, что он делает в организме. В 1992 году работы, использующие «нокаутный» метод, исчислялись единицами; десять лет спустя их поток подошел к отметке 5 тысяч в год. «Нокаутировано» и исследовано уже около 10 тысяч генов (примерно половина мышиного генома). Результатом стало, в частности, появление нескольких сотен «мышиных» моделей человеческих заболеваний – включая такие, казалось бы, не моделируемые на животных болезни, как шизофрения и аутизм. «Нокаутные» мыши помогли ученым разобраться с генетико-биохимическими механизмами спонтанной агрессии, выяснить в деталях механизм действия целого сигнальных молекул и даже решить давние споры. Например, еще с XIX века фармакологи мечтали создать вещество, которое обладало бы обезболивающим действием морфина, но при этом не вызывало бы наркотической зависимости. Увы, опыты с «нокаутными» мышами убили эту мечту: оказалось, что все эффекты морфина релизуются через один и тот же белок-рецептор. «Нокаутирование» гена, который его производит, избавляло мышей от опасности «подсесть» на морфин, а также от угнетения дыхательного центра и моторики желудочно-кишечного тракта (обычные последствия употребления морфина). Но оно же почти полностью снимало и обезболивание.

Кстати, одним из важнейших открытий, сделанных с помощью «нокаутной» техники, стало как раз ошеломляющее разнообразие белков-рецепторов к нейромедиаторам, гормонам и прочим сигнальным молекулам.

До появления этого метода было известно, например, всего два типа рецепторов к нейромедиатору серотонину – сегодня доказано существование по крайней мере 14 отдельных генов и, соответственно, белков, выполняющих эту функцию.

Разумеется, по мере того, как ученые осваивали «нокаутные» технологии, обрисовывались и пределы возможностей нового чудо-метода. Например, оказалось невозможно получить животных с выключенными «генами домашнего хозяйства» – так биологи называют гены, работающие всегда и во всех тканях и обеспечивающие базовые, жизненно важные для любой клетки функции. «Нокаутирование» одного из таких генов означало бы скорую смерть трансформированной клетки без единого шанса развиться во взрослое животное. По сходным причинам трудно применить эту технику к генам, активно участвующим в формообразовании во время эмбрионального развития: результатом будут тяжелые уродства и скорее всего опять-таки смерть. Правда, хитроумные биологи придумали своего рода генетические бомбы замедленного действия – такие «нокаутирующие» конструкции, которые позволяют гену спокойно работать в эмбрионе, а выключают его много позже. Но это слабое утешение: если ген наиболее активен именно во время эмбриогенеза, хотелось бы выяснить прежде всего его роль именно в этот период. Тем не менее так называемый «условный» или «программируемый нокаут» (conditional knockout), позволяющий отключить ген только в определенный момент жизни животного, или в определенной ткани, или просто по химическому сигналу экспериментатора, применяется все чаще, позволяя обойти методические ограничения.

Куда серьезней оказалась фундаментальная проблема, с которой столкнулись генетики.

Экспериментируя с последовательным выключением генов, они обнаружили, что отсутствие в организме любого, даже самого важного фермента или рецептора не приводит к полному подавлению выполняемой им функции – всегда находится какой-нибудь способ (а то и не один) выполнить ее при помощи других веществ и структур.

Этот способ может быть неэффективен, энергетически дорог, связан с синтезом неприятных веществ – но он всегда есть. Если, скажем, блокирован фермент, расщепляющий отработанные молекулы медиатора – организм ответит на это уменьшением синтеза медиатора, или снижением числа рецепторов к нему, или найдет иной способ его утилизации.

Складывается впечатление, что в нашем организме вообще не бывает «единственных путей» и «единственных ключей» (ну разве что за исключением реакций, обеспечиваемых «генами домашнего хозяйства») – все его функции обеспечиваются тонким балансом множества регуляторов с бесчисленными степенями свободы. Это, конечно, очень сильно повышает его (и нашу) надежность, позволяет не выходить  из строя «оттого, что в кузнице не было гвоздя» – от точечной поломки единственного гена. Но это же и затрудняет изучение того, как он устроен: поди-ка разберись, что делает этот ген, если при его выключении ничто не отказывает наглухо!

Впрочем, самим этим представлением о сложности и многофакторности регуляции любой физиологической функции и об огромных компенсаторных возможностях организма мы тоже отчасти обязаны методике «генного нокаута».

Источник: «Что нового в науке и технике» № 3, 2008 ,